入选“十大创新产品”，0 PCR WGS引领高通量测序新时代

日前，华大基因基于自主平台DNBSEQ的“0 PCR全基因组重测序（WGS）”产品成功入选生物通评选的“2019生命科学十大创新产品”。该活动旨在评选出年度令人耳目一新的创新产品，为科研人员提供更多元的选择。评选经由读者投票和专家评鉴，最终确定入选名单。

DNBSEQ™ 0 PCR全基因组重测序（WGS）由于其独特的建库测序方法，颠覆了传统的偏向性PCR高通量测序方法，为科研人员带来前所未有的实验结果，让科研论文耳目一新。

该产品将无扩增错误的PCR-free建库方法与无拷贝错误累积的DNBSEQ™测序技术结合，实现真正的全基因组PCR-free建库和测序，还原基因组真相。与其他平台相比，该技术可有效避免PCR扩增引入的碱基错配^[1]和偏向性^[2]。

图1 DNBSEQ™ 0 PCR WGS建库测序流程图

2019年4月，《中华医学遗传学》杂志上刊发了国内首个低深度全基因组测序技术专家共识——《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》。该共识指出，“因PCR-free方法无PCR扩增偏好性，检测更精准，故推荐用于文库构建”。0 PCR技术将更广泛的应用于临床和科研中。对于那些富含AT或GC、容易产生PCR扩增偏向的基因组区域，0 PCR技术可发挥不可替代的作用。

GC含量偏高/低的基因组无偏性测序

不同物种的GC含量不尽相同，至少有40%的基因组GC含量偏高或者偏低，例如褐潮藻类和小球藻GC含量高达65%以上；而线虫和马来丝虫，GC含量竟然不到30%。对于这些GC含量偏高或者偏低的基因组，常规PCR技术存在明显的扩增偏好性，难以很好地覆盖基因组。

图2 GC含量偏高或偏低的部分基因组

0 PCR WGS让不同GC含量的物种均有较好的基因组覆盖均一性，从而可获得更准确的变异检测结果。用DNBSEQ™ 0 PCR技术对GC含量分别为62%、50%和38%的细菌进行全基因组重测序，基因组覆盖均一性好。

图3 高中低GC含量样本的基因组覆盖均一性比较

全面检测人基因组致病突变

DNBSEQ™ 0 PCR在建库和测序过程中均没有PCR错误，可以全面覆盖基因组的复杂区域，从而更全面地检测体细胞突变^[3][4]，适合肿瘤基因组、罕见突变检测等研究。这也为研究低丰度突变、克隆进化等奠定了良好的基础，有利于全面解析人基因组致病突变，助力精准医学。

同时，0 PCR测序在InDel检测上更是略胜一筹。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多，就分布密度而言, 仅次于SNP。在人类基因组中, 平均密度为每7.2 kb包含一个InDel，所有序列多态性中有16％至25％是插入缺失^[5]。InDel是一种常见的遗传变异形式，已被证明可导致或促成人类遗传疾病和癌症^[6]，例如孟德尔疾病^[7]、急性早期白血病^[8]、肺癌^[9]、肌肉萎缩症^[10]等。

PCR扩增引入了大量易出错的InDel^[11]，比0 PCR测序多检测出3.4万个错误的InDel，而0 PCR测序则可多检测出4万个真InDel。

图4 0 PCR与PCR InDel检测能力比较

提高低深度测序变异检测能力

低深度测序使用较低的测序数据量、较短的测序周转时间、较低的计算存储成本，逐渐成为芯片检测的替代方案^[12]。

但低深度测序因其测序深度低，用传统PCR建库测序会引入扩增错误和偏向性，同时会带来Duplicates高、测序数据浪费、有效测序深度低等问题，对检测结果的准确性会造成比较大的影响。

对瓶中基因组NA12878样本的0 PCR和PCR测序不同深度的数据进行比较，结果表明，DNBSEQ™ 0 PCR技术可以有效将低深度测序SNP检测的敏感度提高5个百分点左右。

图5 低深度测序SNP检测比较

DNBSEQ™ 0 PCR测序，带您进入无PCR高通量测序新时代！

参考文献：

【1】Mcinerney P, Adams P, Hadi M Z. Error Rate Comparison during Polymerase Chain Reaction by DNA Polymerase.[J]. Molecular Biology International, 2014, 2014:287430.

【2】Aird D, Ross M G, Chen W S, et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries[J]. Genome Biology, 2011, 12(2):R18.

【3】Nakagawa H, Wardell C P, Furuta M, et al. Cancer whole-genome sequencing: present and future[J]. Oncogene, 2015, 34(49):5943-50.

【4】Craig D W, Nasser S, Corbett R, et al. A somatic reference standard for cancer genome sequencing[J]. Scientific Reports, 2016, 6:24607.

【5】Mills RE, Luttig CT, Larkins CE, Beauchamp A, Tsui C, Pittard WS, et al. An initial map of insertion and deletion (INDEL) variation in the human genome. Genome Res. 2006;16(9):1182–90.

【6】Hasan M S, Wu X, Zhang L. Performance evaluation of indel calling tools using real short-read data[J]. Human Genomics, 2015, 9(1):20.

【7】MacArthur DG, Tyler-Smith C. Loss-of-function variants in the genomes of healthy humans. Hum Mol Genet. 2010;19(R2):R125–R30.

【8】Paschka P, Marcucci G, Ruppert AS, Mrózek K, Chen H, Kittles RA, et al. Adverse prognostic significance of KIT mutations in adult acute myeloid leukemia with inv(16) and t(8; 21): a Cancer and Leukemia Group B Study. J Clin Oncol. 2006;24(24):3904–11.

【9】Sequist LV, Martins RG, Spigel D, Grunberg SM, Spira A, Jänne PA, et al. First-line gefitinib in patients with advanced non–small-cell lung cancer harboring somatic EGFR mutations. J Clin Oncol. 2008;26(15):2442–9.

【10】Ostertag EM, Kazazian Jr HH. Biology of mammalian L1 retrotransposons. Annu Rev Genet. 2001;35(1):501–38.

【11】Han F, Wu Y, Narzisi G, et al. Reducing INDEL calling errors in whole genome and exome sequencing data[J]. Genome Medicine,6,10(2014-10-28), 2014, 6(10):89.

【12】Bo Z , Ho S S , Xianglong Z , et al. Whole-genome sequencing analysis of CNV using low-coverage and paired-end strategies is efficient and outperforms array-based CNV analysis[J]. Journal of Medical Genetics, 2018:jmedgenet-2018-105272-.

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